摘要:利用聚合酶延伸技术和双链特异性包埋染料的特性，建立了一种快速简便的检测基因点突变的方法。在特异性引物聚合过程中，实时将不同基因型的聚合过程转化为荧光信号，通过监测荧光信号的变化实现基因点突变的快速检测，无需凝胶电泳、荧光、同位素标记等复杂操作。通过对β珠蛋白基因CD17点突变的检测，证明该方法是一种廉价、简便、快速的筛查遗传性地中海贫血β珠蛋白基因CD17点突变的方法，该方法可推广到各种基因的点突变检测。

关键词:点突变；聚合酶；遗传性地中海贫血；基因突变筛查

中国图书馆分类号:Q319.31文献识别码:A文号:1007-7847(2007)04-0295-06。

β地中海贫血(β地贫)是一种常染色体隐性遗传病，是由于β珠蛋白基因突变或缺失，导致珠蛋白HbA(α2β2)的肽链合成减少或不能合成，导致α和β肽链合成失衡。如果胎儿同时收到父母两个β地中海贫血基因，则为突变纯合子，多数表现为重度β地中海贫血。目前没有有效的治疗方法。这些患者往往英年早逝，或者靠输血维持。

点突变是β-地中海贫血基因中最常见的突变。β-珠蛋白基因CDl7(A→T)点突变是最早报道的与β-地中海贫血相关的点突变之一。传统的β-地中海贫血基因突变检测方法是基于凝胶电泳。手术既复杂又费时。目前常用的诊断方法是聚合酶链反应结合斑点杂交，准确性高，但需要放射性同位素标记和繁琐的分子杂交技术。Pun等报道了一种新的变性高效液相色谱基因分型技术，不需要放射性同位素标记，但该方法操作复杂，仪器昂贵，实验周期长。新发展的实时荧光PCR技术已用于检测遗传性血色病中HFE基因的点突变，操作简单，但探针的设计难度和检测仪器的高成本限制了其广泛应用。

基于双链结合染料嵌入双链DNA发出荧光的原理，我们建立了一种简便的室温实时检测聚合酶活性的方法。在此基础上，基于聚合酶延伸技术和双链特异性包埋染料的特性，发展了一种快速简便的点突变实时检测方法，通过包埋染料和改变荧光信号实现点突变检测，无需昂贵的仪器。操作方便简单，无需复杂的凝胶电泳操作和标记。利用该方法检测了β地中海贫血病相关基因CD17的突变，为基因点突变和单核苷酸多态性的检测提供了一种快速、简便、有效的方法，为药物筛选、疾病预防和单体型规划提供了新的手段和思路。

1实验

1.1试剂和仪器

试剂:引物和寡核苷酸由大连宝生物公司(Takara)合成，序列见表1。Klenow Fragment(exo-)聚合酶(KF-酵素，Fermentas)，SYBR Green I(上海科技发展有限公司)，Takara Ex taq酵素(TakaRa)，DNTP合剂(TakaRa)，Tris(适马)，二硫苏糖醇DTT(Bebco)等试剂均为国产分析纯，实验用水均经过过滤，高温灭菌。仪器为美国Perkin Elmer LS-55荧光分光光度计，美国Amersham恒温水浴，ABI公司Ce-neAmPTM PCR System 2700。

1.2实验方法

1.2 1荧光测定

本研究选用双链特异性结合染料SYBRGreen I，用497 nm光测量荧光强度，在520nm处检测。仪器的入射狭缝和发射狭缝均设置为2.5nm，荧光值稳定后，样品在37℃恒温65438±00min测量，样品溶液的最终体积为200 μ l..

1.2.2点突变检测

制备1的基础溶液(引物N3 100 nmol/L，50 mmol/L LTRIS-HCl (pH 8.0)，5mmol/L MgCl2，1 mmol/L ldtr . 50 μm ol/L DNTP混合物，1×SYBR GreenI)，加入n1和最终浓度为100 nmol/L的N2将1mmo|/L DTF、50μmol/L dNTP混合物(同比例)、1×SYBR GreenI)和最终浓度为100nmol/L的N2和N2分别加入到底部液体2中。荧光强度稳定后，加入2.5U KF酶，并连续监测荧光强度的变化。

1.2.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

采用传统的电泳方法验证点突变的检测结果。样品溶液A、B和C在95℃变性5分钟，然后在0℃淬灭5秒，用含7%尿素和银染的20%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

1.2.4温度对检测的影响

分别在25℃、30℃、34℃、37℃、42℃和47℃下，向样品溶液A中加入2.5U KF酶，监测荧光强度的变化。以1000s聚合反应荧光信号值的比值(S/B)为检测标准，考察了温度对检测系统的影响。

1.2.5金属离子对检测的影响

研究了四种金属离子(M2+、Ca2+、K+和Na+)对聚合酶聚合的影响，并通过调节样品溶液A中氯化镁的浓度来研究Mg2+的影响。向样品A中加入CaCl2 _ 2、KCI和NaCl溶液调节至不同浓度，计算参考文献[11]中的初始反应速度，考察离子对聚合反应的影响。

1.2.6地中海贫血遗传病点突变样本的制备和检测

我们在地中海贫血遗传病中检测到一个CDl7(A→T)点突变。样本10份(南方医科大学医学遗传学室纯合子3份，杂合子3份，本实验室正常样本4份)。按照标准DNA提取技术从患者和正常人的白细胞中提取样本的总基因组DNA，引物(表65，438+0)按照引物5。PCR系统(50νL)包含:0.5U TakaRa Extaq酶、0.2mmol/L dNTP混合物、1×PCR缓冲液、800nmol/L N6、10nmol/L N7和50ng总DNA。PCR反应程序如下:94℃变性5min，然后94℃变性。57℃退火35s，72℃延伸30s，循环40次。PCR产物经标准凝胶电泳纯化，检测OD值。在底层溶液3(100 mmol/L引物N5，50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，5mmol/L MgCl2，1mmol/LDTT，50。

2结果和讨论

2.1实验原理

实验原理如图1所示。设计特异性等位基因引物，其3’末端终止于模板的突变(多态性)碱基位点。当模板与引物完全匹配时，引物在聚合酶的作用下延伸形成双链，双链特异性染料插入新生的双链区域，荧光强度增强。然而，当模板和引物在其3’末端不匹配时，引物不能有效地延伸，并且荧光信号没有变化。通过观察荧光信号的变化。实现点突变检测。

2.2点突变检测方法

根据文献[13 ~ 15]，我们用合成的寡核苷酸模拟地中海贫血遗传病CD17的点突变靶序列(表1)，其中N1和N2分别代表点突变的两种纯合基因型。50%的N1/N2混合样本模拟杂合子基因型。图2显示了使用特异性等位基因引物进行点突变检测的结果。引物N3的3’末端终止于突变碱基位点，并与N1的纯合子完全匹配。在聚合酶的作用下，互补的dNTP逐个加到引物的3’-OH端，形成双链结构，染料SYBR Green I包埋在双链中，产生荧光。当模板为N2纯合时，引物N3的3’端与其不匹配，因此聚合延伸反应不能有效发生，荧光信号没有明显增加(曲线3)。当模板为杂合时，荧光信号也显著增强(曲线2)，但其荧光增长率明显低于曲线1。通过荧光的变化，可以有效地区分三种基因型。为了更好的检测点突变，我们还使用了与N2纯合子完全匹配的引物N4进行检测。当模板为N1时，加入聚合酶。由于引物N4的3，当模板为N2时，随着DNA聚合酶的加入，荧光信号迅速增强，当模板为杂合时，荧光也增强，但增长程度小于完全匹配的模板N2。该检测结果与使用N3引物时的结果相同(图中未显示)。

2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳

我们使用传统的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来验证点突变检测结果。在图3中，1 ~ 3道分别是N1、N2和N3的波段。泳道4 ~ 6分别是样品溶液A ~ C的反应样品溶液。我们发现在泳道4(样品溶液A)中，引物N1条带消失，因为引物N1被用作聚合的模板，但是在模板N1条带上方出现了聚合产物条带(引物5被设计用于区分聚合产生的产物和原始模板。泳道5(样品溶液B)不能产生有效的聚合反应，模板N2和引物N3带继续存在:泳道6为样品溶液C的反应液，可见引物带、模板和聚合产物带，但聚合产物带的亮度比泳道4弱，说明聚合产物比泳道4少。上述电泳结果与荧光实验结果一致，表明该荧光分析方法是一种可靠、准确的基因分型方法。

2.4温度对检测的影响

调节恒温水浴使温度分别控制在25℃、30℃、34℃、37℃、42℃和47℃，在样品溶液A中加入聚合酶，监测荧光强度的变化。结果如图4所示。从图4可以看出，随着温度的升高，不加聚合酶时荧光信号与荧光背景的比值(S/B)增大，但当温度超过37℃时，S/B增大。

2.5金属离子对检测的影响

点突变检测是基于聚合酶延伸反应。聚合酶的聚合效率对该方法的信号产生和灵敏度有重要影响。我们研究了几种重要的金属离子(Mg2+、Ca2+、K+、Na+)对聚合反应的影响(图5)。从图中可以看出，当M不存在时，聚合反应无法发生，随着Mg2+浓度的增加，初始反应速度加快。当Mg2+浓度达到10 ~ 15 mmol/L时，初始反应速度最快，当浓度继续增加时，在一定程度上抑制了聚合酶的活性，说明Mg2+在反应中作为聚合酶的激活剂是必不可少的。然而，当Ca2+浓度大于30 mmol/L时，低浓度Ca2+(小于20mmol/L)对聚合酶活性几乎没有影响..对反应速度有明显的抑制作用；K+和Na+的存在抑制了聚合酶的活性，并且随着浓度的增加，聚合酶的活性受到抑制。当K+和Na+浓度高于100mmol/L时，聚合反应基本被抑制。

2.6地中海贫血病点突变的基因分型

地中海贫血是一种遗传性血液病。我们检测到一种CDl7点突变类型，结果如图6所示。从图中可以看出，不加聚合酶时，三种基因型的荧光信号相似，但加聚合酶后，三种基因型之间存在明显差异，加聚合酶后突变纯合子完全匹配引物(N5)的荧光信号急剧增强(曲线1)。野生型纯合子加入聚合酶后，荧光信号没有明显变化(曲线3)。然而，在聚合酶中加入杂合子后，荧光信号也大大增强。但荧光明显低于突变纯合子(曲线2)。通过加入染料分子，观察荧光信号，可以方便、快速、准确地识别CDl7(A→T)的点突变。

3结论

基于聚合酶延伸技术，通过双链特异性荧光染料的包埋，由荧光信号的变化直接给出点突变的基因分型结果。该方法不需要放射性同位素标记或引物和寡核苷酸的荧光标记。成本低；实验操作简单，无需凝胶电泳检测和复杂昂贵的仪器，为点突变引起的遗传病的预防和筛查提供了一种简单快捷的方法，也为单核苷酸多态性的单体型规划提供了一种新的思路。

作者简介:孟湘贤(1972 ――)女，湖南华容人，湖南大学副教授，博士，从事分子水平的生物分析化学研究；王克民(1957-)，男，湖南沅江人，教授，博士，通讯员，从事纳米和分子水平的生物分析化学和纳米生物技术研究。